技(ji)術(shu)原理
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats）是最新(xin)出(chu)現的(de)一種由(you)sgRNA指導(dao)Cas核酸(suan)酶對靶向基(ji)(ji)因進行特定(ding)DNA修(xiu)飾的(de)技術。在這一系(xi)統(tong)中(zhong)，sgRNA引導(dao)序列靶定(ding)位點剪切雙(shuang)鏈(lian)DNA達到對基(ji)(ji)因組DNA 進行修(xiu)飾的(de)目(mu)的(de)。CRISPR/Cas9系(xi)統(tong)能夠對小鼠基(ji)(ji)因組特定(ding)基(ji)(ji)因位點進行精確編輯，目(mu)前瑞(rui)思(si)元已經成功將此技術應用于小鼠基(ji)(ji)因敲(qiao)除/敲(qiao)入模型制(zhi)(zhi)備(bei)，以及(ji)條件(jian)性(xing)敲(qiao)除（Loxp系(xi)統(tong)）模型制(zhi)(zhi)備(bei)。
目(mu)前瑞思元采取優化過(guo)的野生型Cas9和雙切口Cas9n（Optimized Cas9 System,OCAS and OCASn）。采用優化過(guo)的雙切口Cas9n(OCASn)可以將脫(tuo)靶效應降到最(zui)低。
常規基因敲入
利用CRISPR/Cas9基(ji)因敲入技術，針(zhen)對靶基(ji)因設計、構(gou)建相應的(de)gRNA質(zhi)粒和donor質(zhi)粒，通(tong)過(guo)Cas9核酸酶的(de)切割作用和同源臂的(de)同源重組，引入特(te)定的(de)突變、報告(gao)基(ji)因（如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等(deng)）或需要(yao)表達的(de)功能性cDNA（如(ru)cre、Dre等(deng)）到目(mu)的(de)基(ji)因(yin)的(de)特(te)定位(wei)點。
條件性基因(yin)敲入
利用CRISPR/Cas9基(ji)因敲入技(ji)術，針對靶(ba)基(ji)因設計、構建(jian)相應的gRNA質粒(li)和donor質粒，將外源基因或特定突變敲入引入到基因組(zu)目(mu)的(de)基因的(de)特定位點。
Rosa26位(wei)點定點敲入
根據Rosa26基(ji)因序(xu)列(lie)(lie)設計合成sgRNA，將構建包含同源序(xu)列(lie)(lie)和目(mu)的序(xu)列(lie)(lie)的片(pian)(pian)段(duan)與Cas9、sgRNA共同顯微注射入受精(jing)卵中，Cas9/sgRNA復合體與基(ji)因組靶序(xu)列(lie)(lie)結合并切(qie)割雙鏈(lian)DNA，以含目(mu)的片(pian)(pian)段(duan)的同源序(xu)列(lie)(lie)為模(mo)版(ban)修復基(ji)因組DNA，最終獲得在Rosa26基(ji)因intron中定點(dian)插入片(pian)(pian)段(duan)的大(da)小鼠。
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